二氧化氮熏蒸法控制未去壳花生的微生物*

摘要

储存的花生通常需要治疗来控制微生物感染以及昆虫以保持采后质量。一氧化氮(NO)是最近发现的采后害虫控制的熏蒸剂。不得在超低氧气条件下进行熏蒸以保持不,并始终含有NO2.由于NO与氧和NO反应2.有抗菌性质。因此,NO熏蒸法在防治害虫和病原菌方面具有一定的潜力。在本研究中,我们评估了NO的抗菌作用2.对未经高温消毒的未去壳花生进行熏蒸。用0.3%、1.0%和3.0% NO熏蒸花生2.25度,三天˚将NO气体注入玻璃罐中,与O反应2.在大气中。熏蒸后,从完整的花生样品中收集冲洗微生物样品,然后用非选择性胰蛋白酶肉汤培养基裂化的开口花生样品。然后用非选择性培养基和真菌选择性马铃薯葡萄糖培养基稀释洗涤样品,并在蔬菜上进行测试基于培养基耗氧的快速计数试验。这三个没有2.熏蒸处理对完整花生和破碎花生均有显著的抑菌和抗真菌作用,3.0% NO对花生有完全抑制作用2..熏蒸对皮肤花生核的出现没有明显的影响。这些结果表明没有2.熏蒸有可能对储存产品进行微生物,没有熏蒸,没有毫无疑问2.有潜力控制储存产品上的昆虫和微生物。

分享和引用:

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1.介绍

花生是一种重要的食品类商品在全世界每年生产约45万吨。美国生产的是中国,印度和尼日利亚之后的第四大。在2019年,美国生产2490220吨花生为$ 1十亿[1] [2]的市场价值。花生生产可以通过病虫害采前在现场和采后储存和运输期间受到影响。关于采后贮藏期间花生10〜25%的损失据报道,在亚洲[3]。存储花生往往面临感染的微生物,从而在品质和市场价值的减少,并增加健康风险。受感染的花生及其加工品已与食源性疾病,由病原性细菌,如相关联的沙门氏菌李斯特菌物种[4][5]。花生的真菌感染可能发生在田间,并在贮藏过程中持续发生,常见的贮藏真菌病原体包括镰刀,青霉菌,曲霉属真菌物种[6]。其中,曲霉属真菌flavus感染是食品安全的主要威胁,因为它产生致癌性黄曲霉毒素[6]。在花生采后贮藏过程中,高温、高湿、机械损伤和虫害均可促进花生的微生物侵染。

虫害也是花生贮藏过程中的一个严重问题。印度飞蛾(Plodia内窥镜)、红粉甲虫(种有害castaneum)和米饭蛾(科西拉岛cephalonica)是美国及其他地区贮藏花生的主要害虫,花生[6][7]中虫灾与真菌侵染之间存在较强的相关性。虫害也会导致湿气和热量的增加,从而促进真菌的生长。因此,采后处理控制昆虫和微生物将是非常可取的。摘要为控制储藏花生中的害虫和真菌,主要采用杀虫剂、杀菌剂和化学熏蒸等方法。常用的熏蒸剂甲基溴由于其臭氧消耗效应已逐步淘汰。磷化氢作为甲基溴的主要替代品,常用于贮藏花生[7]。但由于磷化熏蒸处理时间长,对某些昆虫有耐受性或抗性[8]。

一氧化氮(NO)是近年来发现的一种防治采后害虫的熏蒸剂。因为NO和O反应2.自发形成二氧化氮(NO2.NO熏蒸必须在超低氧(ULO)环境下进行,以保存NO,并以N终止2.-冲洗,以防止NO与O反应2.形成不2.[12].不2.NO熏蒸结束时形成的物质会对新鲜产品造成伤害[12][13],并导致硝酸盐、亚硝酸盐和NO残留量增加2.[14]。

NO和NO2.气体具有抗菌性能。据报道,NO通过DNA-、脂质-或蛋白结合[15][16][17][18]引起细菌和真菌的细胞损伤。不2.还可以通过诱导单链DNA和细胞壁组分的破损来灭活微生物[19] [20] [20] [21]。不2.气体已被用来对医疗器械进行消毒。我们之前证明了用1.0% NO或0.1% NO进行熏蒸2.完全控制曲霉属真菌flavus被捕获在硝化纤维素膜上的孢子体外探讨贮藏杏仁[24]的微生物控制方法。NO熏蒸对杏干[25]上的微生物也有较好的防治效果。这些熏蒸在灭活大多数其他农产品微生物方面的有效性尚未得到研究。

没有熏蒸,没有适当的否,没有2.为控制昆虫和微生物在单一熏蒸处理将是非常可取的。NO熏蒸对贮藏产品害虫的防治效果早在[9]中已得到证实。在这项研究中,我们进行了活泼地2.熏蒸试验证明NO的杀微生物效果2.对未经高温消毒的带壳花生。

2。材料和方法

2.1.气体和花生

压缩一氧化氮(NO, >99.5%)购自Praxair, Inc. (Salinas, CA)。韦克菲尔德花生公司(韦克菲尔德,弗吉尼亚州)从网上商店获得未经高温消毒的未去壳的弗吉尼亚花生,并在室温下保存在塑料袋中。

2.2.不2.熏蒸程序

一组用Kimwipes纸巾包裹的10颗花生被放置在一个1.9升的玻璃罐中进行熏蒸处理。将NO气体注入处理罐中,与常温下的O反应2.形成不2..熏蒸处理0.0%(对照),0.3%,1.0%和3.0%NO2.在常温下向熏蒸罐中注入适量NO气体进行试验。然后将熏蒸瓶置于25˚C的环境舱中3天完成处理。为了终止熏蒸,这些罐子在通风柜中通风30分钟。每个处理重复4次。

2.3.花生微生物洗涤样品的制备

将每种治疗的10个非屏蔽的花生置于Ziplock中®冷冻储存袋(17.8厘米*18.9厘米,新不伦瑞克,NJ)用100mL胰酶大豆肉汤(TSB,赛默飞世尔科技,沃尔瑟姆,MA)和花生样品通过旋动袋在室温下5分钟洗涤。的洗掉溶液A 10毫升等分试样以确定完整带壳花生外侧表面的微生物载荷。

在剩下的90毫升TSB的花生破获打开,然后通过旋动袋五分钟再洗净。的洗掉溶液A 10毫升等分试样用于测定花生总微生物负载。

将上述每个样品的两个4 mL等量稀释10倍以供枚举。每个样品用非选择性TSB培养基稀释一个4ml,以确定总微生物负荷(细菌和真菌)。每个样品的第二个4毫升溶液用选择性马铃薯葡萄糖肉汤(PDB, Alpha Biosciences, Baltimore, MD)稀释,并添加100 mg/L的氯霉素(RPI, Mount Prospect, IL),以确定真菌负荷。

2.4. 绿灯计数测试TM值系统

蔬菜TM值采用快速枚举试验(930系列,MOCON,明尼阿波利斯,MN),按照之前描述的[24][26]方案枚举花生稀释洗脱液中的微生物负荷。该系统测量溶解氧在样品介质中的时间长度在一个特殊的APCheckTM值瓶(15毫升容量,Oculer, Tipperary,爱尔兰),由于微生物的有氧代谢活动而下降到阈值水平。瓶子是透明的,底部有一个氧气传感器,它会随着介质中溶解氧水平的变化而改变颜色。氧传感器的颜色是由位于系统中小瓶下方的检测器测量的,以确定介质中的溶解氧水平。每个小瓶包含10毫升的1:10稀释样品,用于枚举。将TSB和PDB稀释后的样品分别用于细菌和真菌的联合负荷测定和仅测定真菌的负荷测定。在32˚C条件下进行19 h总微生物量计数,在25˚C条件下进行50 h真菌量计数。

在GreenLight中构建参考校准曲线作为达到阈值(小时)的时间之间的相关性TM值快速枚举试验和菌落形成单位(CFU / mL)在来自对照花生的原始洗涤样品的相同连续稀释液中的经典活菌落计数试验中。对于校准曲线,使用TSB和PDB对来自对照的原始洗涤溶液分别用于组合细菌和真菌和真菌和真菌的组合,如上所述,并用TSB串联稀释至1 / 100,000稀释度,最多1/ 1000稀释液用PDB。以与上述熏蒸的样品相同的方式进行对照样品的枚举。使用100μL等分试样在32℃的Tsb琼脂平板上使用100μl等分试样的稀释液进行的经典可行菌落计数2天,并在25℃的PD​​B琼脂平板上在PDB琼脂平板上温育100μl用PDB的稀释液。

2.5。数据分析

在单向异常分析(ANOVA)的单向分析之前,熏蒸样品的微生物的殖民地数量是对数转化的。Tukey HSD测试(P= 0.05)和双尾未配对学生的T-检验用于比较多重平均数和配对平均数。所有统计分析使用JMP统计发现软件[27]。熏蒸处理的相对菌落减少是根据对照样本的菌落数量计算的,假设所有处理和对照(如果没有处理效果)的预期菌落形成数量相同。

结果

2.熏蒸抑制外表面上的微生物,并壳内的花生内部壳,并且随着不增加的情况而增加了效果2.浓度。当用非选择性TSB培养基稀释完整花生的洗脱样品时,绿光TM值结果表明,烟熏NO含量分别为0.3%、1.0%和3.0%2.与对照相比,分别有8.3%、0.0%和0.0%的菌落形成图1(a) )。不同处理间菌落形成存在显著差异(F= 252.123; df=3,44;P< 0.0001)。用于熏蒸的破碎花生洗涤样品的TSB稀释量为0.3%、1.0%和3.0% NO2.相对于对照,分别产生6.2%,0.0%和0.0%的菌落形成(图1(a) )。不同处理间菌落形成存在显著差异(F= 320.362;Df = 3,44;P< 0.0001)。破碎对照花生的微生物量(354.0%)显著高于完整对照花生(F= 4.477; df=1,22;P= 0.0459) (图1(a))。

(一)(b)

图1.3天NO的影响2.在25˚C下对未包装花生的微生物负载进行熏蒸。在花生裂开之前和之后,从未脱壳花生样品中提取冲洗样品。将用非选择性胰蛋白酶大豆肉汤(a)和真菌选择性马铃薯葡萄糖肉汤(补充有100 mg/L氯霉素(b))稀释的冲洗样品置于绿光下TM值快速计数试验分别测定细菌+真菌和仅真菌的菌落形成单位(CFU)。CFU数据用Log10进行转换,然后用Tukey HSD检验进行单因素方差分析(P= 0.05)和双尾未配对的学生T-测试。相同字母的CFU/mL(在条顶)平均值无显著差异。假设对照的CFU为100%,计算每个处理的相对菌落形成率(%)。

当使用真菌选择性PDB培养基稀释完整花生洗脱样品为GreenLightTM值枚举,熏蒸,0.3%,1.0%,3.0%不2.相对于对照,分别导致2.0%,0.0%和0.0%的菌落形成(图1(b))。治疗中的菌落形成存在显着差异(F= 369.358;Df = 3,44;P< 0.0001)。PDB稀释后的花生样品为0.3%,1.0%和3.0% NO2.与对照相比,熏蒸处理的菌落形成率分别为16.9%、0.2%和0.0%(图1(b))。治疗中的菌落形成存在显着差异(F= 91.5142;Df = 3,44;P< 0.0001)。来自破裂的对照花生的真菌载荷显着高于完整的对照花生(214.7%)(F= 18.7364;Df = 1,22;P= 0.0003) (图1(b))。

GreenLight中达到阈值次数之间的相关校准曲线TM值针对TSB和PDB培养基,绘制了经典平板菌落计数中的快速计数试验和菌落形成单位(CFU/mL)图,用于连续稀释的对照花生冲洗样品。在这两种类型的介质中,这两个参数之间存在强而显著的相关性(TSB:y=−1.2374x+8.1698,R2.= 0.9432;PDB: y =−5.8260x + 30.3214, R2.= 0.9219) (图2.).

(一)(b)

图2..线性回归时间结果(小时)在上在古典菌落计数测试菌落形成单位(CFU LOG10 / mL)的绿激光™快速枚举测试。(a)由使用非选择性的胰蛋白酶大豆肉汤中制备并在32℃测试的控制花生洗掉样品的系列稀释液;(b)中的系列稀释液洗掉从使用补充有100mg / L的氯霉素的并在25℃测试的真菌选择性马铃薯葡萄糖肉汤中制备对照样品花生。厚灰线代表下和上95%预测区间。Pearson相关系数是(a)-0.9712(P< 0.0001) and (b)−0.9602 (P< 0.0001)。

与对照花生相比,熏蒸处理的未脱壳花生表面似乎稍暗,但在三种熏蒸处理中没有区别(图3.).经熏蒸处理的去壳花生与对照花生相比颜色较深,且随着NO浓度的增加颜色逐渐变深2..熏蒸治疗和对照中皮肤花生的颜色没有差异。

4。讨论

2.熏蒸对花生表面和内部的细菌和真菌有较好的控制作用。3天熏蒸NO≥1.0%2.结果几乎完全控制花生上的微生物(图1).NO . 5中使用的无壳花生2.在熏蒸试验之前,对熏蒸进行了检查,仅使用未受损的完整花生。破碎花生的CFU/mL显著高于完整花生的CFU/mL,表明花生中含有大量的细菌和真菌。

真菌通过种子开发,收获和花生储存与花生有关,它们经常引起差的萌发,心碎和霉菌毒素污染[28]。花生上的储存真菌包括物种曲霉属真菌,青霉菌,根霉,镰刀[29]。曲霉属真菌flavus由于其致癌性黄曲霉毒素生产,它们是最重要的。在目前的研究中实现了对所有细菌和真菌的几乎完全控制。因此,假设没有是合理的2.熏蒸对上述所有主要的真菌污染物有效。但是,这些令人鼓舞的结果是基于小型实验室熏蒸测试。需要较大的熏蒸测试来验证小实验室熏蒸的功效,并开发实用性2.熏蒸测试。

图3..的影响不2.熏蒸直观,壳和皮肤花生的视觉外观。未经抑郁的,未剥离的花生被熏蒸,0.3%,1.0%和3.0%的NO2.在25℃下保存3天。

NO的抗菌作用2.目前研究的花生熏蒸与先前的抗真菌效应结果一致体外研究[23]和抗微生物作用对储存的杏仁[24]。0.1%NO的熏蒸2.0.3%没有2.足以完全控制杏仁上的真菌。对未去壳花生,NO≥1.0%进行熏蒸处理2.完全控制真菌需要,表明需要开发用于微生物对照的特定产品的熏蒸处理。花生壳由木质保护层与碳水化合物,脂质和酚类化合物[30]组成,并且该特征可以用作保护微生物的物理障碍2.熏蒸。

任何熏蒸都不能有效控制各种农产品上的昆虫和螨虫[9][10][31]。其中,人工感染的无壳花生上的鳞茎螨完全通过在20˚C下用2.0%NO进行一天熏蒸来控制[32]。不像没有2.熏蒸,NO熏蒸必须在超低氧条件下进行,以保存NO,因为NO会与氧气自发反应生成NO2.. 因为完全除氧在商业熏蒸环境中是不现实的,所以任何熏蒸都不包含任何污染物2..通过控制啊2.初始n的级别2.气体冲洗,NO熏蒸可以达到控制害虫和NO的理想水平2.用于微生物控制。因此,一种熏蒸处理,具有理想的不2.+不组合可以在花生上控制微生物和害虫。这种熏蒸策略将是实用且经济的,因为储存的花生经常面临害虫侵扰和微生物感染。昆虫害虫促进真菌入口,在花生和昆虫侵蚀中传播与真菌感染相关[6]。

已经使用了几种熏蒸剂来控制储存的花生对害虫和微生物。甲基溴熏蒸对于害虫和病原体有效,并且有效地控制储存的花生中的红面粉[33]。但是,由于其对大气臭氧的破坏性影响,它不再适用。磷熏蒸主要用于采后害虫控制,尽管还报道了七天磷熏蒸控制曲霉属真菌花生[34]的种类和黄曲霉毒素的产生。而磷化氢是一种缓效熏蒸剂,磷化氢熏蒸可达10天以上,对一些储存品昆虫[8][35]进行控制。有些昆虫对磷化氢[36]产生了抗性。用环氧丙烷熏蒸可以有效地控制花生上的印粉蛾,但这种熏蒸剂具有挑战性,因为它在空气中浓度从3%到37%的时候具有很高的可燃性。

总之,没有2.经证明,熏蒸对未去壳花生表面和内部的微生物均有抑制作用,因此,有潜力控制储藏花生和其他储藏产品上的微生物。NO + NO熏蒸2.因此,在控制储藏花生和其他储藏产品上的昆虫和微生物方面,有可能成为甲基溴的有效和安全的替代品。有必要进行更多的研究,以开发无污染的实用熏蒸处理方法2.不+不2.用于控制储藏产品上的微生物以及昆虫和微生物。

致谢

我们感谢T. Masuda进行技术援助。本研究部分受到美国农业部,外国农业服务部的专业作物计划赠款(Tasc-C2020-01)的技术援助。

笔记

*本文仅报告了研究结果。提及专有产品,本出版物的商品名称或商业产品不是提供具体信息的目的,并且不构成美国农业部的认可或建议。美国农业部是一个平等的机会提供者和雇主。

#通讯作者。

利益冲突

作者宣布没有关于本文的出版物的利益冲突。

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